高效液相色谱法测定龙葵中的澳洲茄胺
目的建立龙葵中澳洲茄胺的高效液相色谱(HPLC)检测方法。方法采用甲醇酸水超声提取龙葵生物碱,在回流条件下对生物碱苷进行酸性水解,得到相应的澳洲茄胺。然后进行高效液相色谱检测,色谱条件:色谱柱为DiamonsilC18色谱柱(250mm×4.6mm),乙腈-0.05%七氟丁酸(30∶70)体系为流动相,流速为1.0ml/min,检测波长为210nm。结果龙葵生物碱获得了良好的基线分离;澳洲茄胺的线性范围为102~612μg·ml-1(r=0.9999);加样回收率超过96.0%,RSD为3.35%(n=6)。结论该方法简单快速,准确可靠,可作为龙葵药材及其制剂的质量控制方法。该方法也为龙葵质量标准的制定及进一步的药效学研究提供了可靠的数据和方法学平台。
龙葵SolanumnigrumL.为茄科(Solanaceace)植物龙葵一年生草本植物,别名野葡萄、老鸦眼睛草、苦菜、苦葵[1]。龙葵全草均可入药,其生物活性成分主要包括甾体类生物碱、多糖、维生素A和维生素C等。其中,甾体类生物碱具有抗肿瘤活性,龙葵也因此被列为十大抗肿瘤中草药之一[2~5]。
龙葵生物碱主要以生物碱苷的形式存在[5],由于苷元与生物碱苷存在对应关系,因此以苷元来定量龙葵生物碱是常用的分析手段。澳洲茄碱(solasonine)和澳洲茄边碱(solamargine)是龙葵的主要活性成分,它们水解后的苷元是澳洲茄胺(solasodine)(见图1)。文献常采用测定澳洲茄胺来定量龙葵生物碱,包括重量法、电位滴定法、比色法和薄层扫描法[6]。但是,这些方法操作繁琐,准确度差。近年来,高效液相色谱凭借其优异的分离分析能力已成为中药这一复杂体系的强有力的分析工具。最近,蒋新宇等[7]基于澳洲茄胺的分析,提出了一种龙葵中甾体类生物总碱的高效液相色谱检测方法。但该方法侧重于龙葵生物碱的提取、水解过程,其高效液相色谱检测过程仍有待进一步优化。本研究通过对提取分离各环节的实验优化和严格的方法学验证,提出了一种简单可靠的澳洲茄胺的高效液相色谱定量方法。
1器材与方法1.1仪器与试剂Agilent1100Series高效液相色谱仪;电子天平(MettlerAE240,德国);KQ318T型超声清洗器(昆山市超声波仪器公司);高速粉碎机(FW-100型,北京市永光明医疗器械厂);pHS-3C酸度计(上海雷磁分析仪器公司)。
澳洲茄胺(Solasodine)对照品购自Sigma-alderich公司(圣路易斯,美国);流动相用的甲醇和乙腈均为色谱纯,其余试剂为分析纯。全程使用二次蒸馏水。
龙葵药材全草购自南昌汇仁堂药店。龙葵果实由江西樟树某药材经销商友情提供,经常规植物分类学方法鉴定为茄科(Solanaceace)植物龙葵的果实。
1.2色谱条件DiamonsilC18色谱柱(250mm×4.6mm)。流动相为乙腈-0.05%七氟丁酸(30∶70);流速1.0ml/min;检测波长210nm;进样量20μl。
1.3溶液的制备1.3.1对照品溶液精密称取对照品适量,加甲醇溶解,所得澳洲茄胺的浓度为1.02mg/ml。
1.3.2样品溶液精密称取龙葵药材2g,加甲醇20ml,1.0M盐酸10ml,超声提取40min,收集上清液,滤过。向滤液中续加6M盐酸5ml,回流水解1h。趁热挥去回流液中的甲醇,以氨水调pH值至10,继以醋酸乙酯萃取两次。分取醋酸乙酯层,挥干溶剂,残渣以适量甲醇溶解,转入10ml容量瓶,以甲醇稀释至刻度,分析前以0.45μm滤膜滤过。对龙葵果实的样品溶液,在进样前稀释10倍。以澳洲茄碱水解为澳洲茄胺为例,水解反应示意图见图1。
2结果2.1提取方法的选择文献多采用回流法提取龙葵生物碱,该方法繁琐费时。近年来,超声提取法已被广泛应用于中药活性成分的提取。本实验对这两种提取方法做了系统比较,发现超声提取简单快速,且能达到相同的提取效率。此外,对龙葵生物碱的水解条件诸如溶液pH,甲醇含量,水解时间等进行了考察,获得了上述优化条件(见“1.3溶液的制备”项)。
2.2色谱条件的确定澳洲茄胺分子缺少共轭双键结构,紫外吸收较弱,对其进行紫外检测时只能要么进行衍生,要么选择其末端吸收。当采用末端吸收波长进行检测时,色谱流动相最好采用截止波长低的乙腈。但是,龙葵生物碱的色谱保留不强,如果采用洗脱强度大的流动相,势必影响分离。同样,由于采用末端吸收进行检测,也不利于梯度洗脱,否则基线漂移严重。在大量实验的基础上,我们优选了“1.2”项所述的色谱检测条件。如图2所示,在该条件下,澳洲茄胺在
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